Nanobodies: Domäne mit Potenzial für Therapie und Diagnostik

Nanobodies sind die kleinsten, funktionellen Antikörperfragmente mit hoher Affinität für ihr Zielantigen, hoher Stabilität und guten Penetrationseigenschaften. Hiermit könnten so manche Limitationen konventioneller Antikörper überwunden werden. Cilta-cel (Carvykti^®), das erste in der EU zugelassene Nanobody-basierte CAR-T-Zell-Produkt, zeigte bereits Erfolge beim refraktären/rezidivierten Multiplen Mye­lom (r/r MM) (1, 2).

Ausgangspunkt konventionelle Antikörper

Monoklonale, bispezifische, multi­spezifische Antikörper – die Palette ist groß, die Anwendung aber nicht ohne Herausforderungen. So sind Full-size-Antikörper mit etwa 150 kDa relativ groß, was das Eindringen in Gewebe erschwert und die Aufnahme in Zellen nur über einen Rezeptor ermöglicht. Außerdem sind sie relativ instabil und werden im Körper schnell abgebaut (3, 4). Sie bestehen aus 2 identischen schweren und leichten Ketten (H/L) aus konstanten und variablen Domänen (C/V), die über eine kovalente Bindung relativ fest miteinander verknüpft sind (Abb. 1). Das Zielantigen wird am kürzeren Ende der Y-Struktur an den variablen Domänen VH und VL gebunden; der Fc-Teil am anderen Ende des Moleküls bestimmt die Effektor-Funktionen. Die Antikörper-produzierenden Plasmazellen des Körpers werden durch Rekombination verschiedener Genabschnitte darauf getrimmt, ihr Leben lang einen spezifischen Anti­körper zu bilden; im Labor werden Anti­körper in der Regel rekombinant hergestellt (4).
 

Abb. 1: Von Full-size-Antikörpern bis Nanobodies. Typisch für alle Konstrukte ist die Domänenstruktur (mod. nach (4)). Nanobody: Single domain antibody, Einzeldomänenantikörper, VHH

Schon kleiner sind Antikörperfragmente

Die Erfolgsgeschichte der Nano­bodies (Nanokörperchen) begann bereits in den frühen 1990er Jahren, nachdem bei Kameltieren unkonventionelle Antikörperkonstrukte entdeckt und von der Gruppe um Hamers-Casterman später als Heavy-Chain-Only-Antibodies (HCAbs) bzw. Schwerketten-Antikörper beschrieben wurden (5). Verschiedene weitere Antikörperfragmente wie Minibodies und single-chain fragment variable (scFV) fanden nach und nach ihren Weg in die Anwendung, u.a. durch Radiolabeling für den Einsatz in Posi­tronenemissionstomographie (PET) und single-photon emission computer tomography (SPECT) (Abb. 1) (2-4).

Nanobodies – eine Domäne mit nützlichen Eigenschaften

Nanobodies sind die kleinste Variante der Antikörperfragmente. Sie bestehen aus einer einzelnen Aminosäure­kette, die nur eine Domäne bildet, weshalb sie auch als Eindomänen­antikörper oder single domain antibody bezeichnet werden. Über diese sog. heavy-chain variable domain (VHH) erfolgt die Antigen­erkennung (Abb. 1) (3, 4). Mit 12-15 kDa und einer Größe im einstelligen Nanometerbereich sind Nano­bodies 10x kleiner als herkömmliche Antikörper und unterscheiden sich auch in ihren Eigenschaften (2, 4):

•    gute Gewebepenetration
•    Erkennung verborgener Antigene
•    gute Löslichkeit (stark hydrophil)
•    hohe Stabilität
•    Hitze-/Säurebeständigkeit
•    renale Elimination
•    verringerte Immunogenität

Vor- und Nachteile von Nanobodies

Aufgrund ihrer kleinen, säuretoleranten Struktur lassen sich Nanobodies im Labor so optimieren, dass sie die Magen-Darm-Passage überstehen und sich damit auch für die orale, lokale Anwendung im Gastrointestinaltrakt eignen könnten. Eine orale systemische Anwendung kann allerdings besonders durch Abbau und verringerte Resorption erschwert werden (2).

Darüber hinaus führt die kleine Größe zur raschen Ausscheidung über die Niere, was zu einer kurzen Halbwertszeit und Wirkdauer führt. Je nach Anwendung als spezifisches Diagnostik- oder Therapie-Tool kann dies von Vorteil oder Nachteil sein (2).

Für viele Anwendungen von Vorteil ist auch die geringe Immunogenität der Nanobodies, die auf dem Fehlen der konstanten Domänen beruht. Bei einem konventionellen Antikörper vermittelt der Fc-Teil aus konstanten Domänen die Bindung an Fc-Rezeptoren; die Fc-abhängige Aktivierung des Komplementsystems und antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) können so zu unerwünschten Effekten führen, die mit Nanobodies umgangen werden könnten (2).

Allerdings ist die Herstellung der Nanobodies noch relativ aufwendig und erfolgte bisher über Immunisierung von Kameltieren, Identifizierung und Selektion relevanter VHH-Domänen mittels Phage Display Librarys und letztlich Produktion im rekombinanten System (2, 3).

Entwicklungen von Therapie bis Diagnostik

Inzwischen wurden vielfältige Einsatzbereiche für Nanobodies untersucht (Abb. 2) (2), darunter

•    funktionelle Nanobodies als Agonisten/Antagonisten
•    zielgerichtete Wirkstoffe von Enzym-Prodrug-Therapie bis Radionuklidtherapie (RNT)
•    Nanobites (bispezifische T-Cell-Engager, BiTEs)
•    nanoCAR-T-Zellen
•    Nanobodies für PET/SPECT für Diagnostik und Monitoring
 

Abb. 2: Auswahl von Ansätzen zur Nanobody-basierten Diagnostik und Therapie (mod. nach (2)). TAM=Tumor-assoziierte Makrophagen

Doch trotz aller Möglichkeiten gibt es in der EU bisher nur wenige Zulassungen für die Therapie: Cilta-cel zur Behandlung von r/r MM und Caplacizumab (Cablivi^®) bei erworbener thrombotisch-thrombozytopenischer Purpura (aTTP). In Japan ist außerdem der anti-TNFalpha Nanobody Ozoralizumab zur Behandlung von rheumatoider Arthritis zugelassen (2, 4).

Cilta-cel verringert Progressionsrisiko bei r/r MM

Im Mai 2022 erteilte die EU-Kommission auf Basis der CARTITUDE-Studie die bedingte Zulassung für das Nanobody-basierte CAR-T-Zell-Produkt Cilta-cel zur Behandlung von r/r MM bei erwachsenen Patient:innen mit mindestens 3 vorausgegangenen Therapien (1). Die extrazelluläre Domäne des CAR-T-Zell-Rezeptors ist gegen BCMA gerichtet, das bei MM-Patient:innen auf plasmazytoiden dendritischen Zellen deutlich exprimiert ist und Überleben und Resis­tenz der malignen Zellen fördert (1). Bei bisherigen CAR-T-Zell-Therapien wurden monoklonale Antikörper oder scFv als Antigen-Targeting-Domäne genutzt; Cilta-cel nutzt nun erstmalig Nanobodies (Single-Domain-Antikörper). In der zur Zulassung führenden Studie wurden 18 Patient:innen nach Lymphodepletion mit Cilta-cel behandelt und eine frühe, tiefe Response mit tragbarem Sicherheitsprofil erreicht (1). Die nun veröffentlichten Daten der Phase-III-Studie CARITUDE-4 mit Patient:innen (Lenalidomid-refraktär mit 1-3 vorausgegangenen Therapie­linien, einschließlich Proteasom-Inhibitor und IMiD) zeigten eine signifikante Verbesserung von Progression, Überleben und Nutzen/Risiko-Profil gegenüber Standardtherapie (Pomalidomid, Bortezomib und Dexamethason (PVd) oder Daratumumab, Pomalidomid und Dexamethason (DPd) (1).

Caplacizumab gegen aTTP

Im Bereich der Hämatologie wurde bereits 2018 der erste Nanobody in der EU zugelassen: Caplacizumab für die Behandlung der aTTP, einer seltenen Gerinnungsstörung. Der humanisierte, bivalente Nanobody wird mittels rekombinanter DNA-Technologie in E. coli hergestellt, bindet an die A1-Domäne des von-Willebrand-Faktors und blockiert dessen Interaktion mit Thrombozyten; die Ausscheidung erfolgt renal. Die Behandlung mit dem als Orphan Drug anerkannten Nanobody reduziert die Zeit bis zur Normalisierung der Thrombozyten sowie die Hospitalisationszeit und verbessert das ereignisfreie Überleben (6).

Diverse Nanobody-Entwicklungen ohne EU-Zulassung

In Japan wurde 2023 der trivalente anti-TNFalpha Nanobody Ozoralizumab zur Therapie einer sonst nicht beherrschbaren rheumatoiden Arthritis zuge­lassen; durch eine albuminbindende Komponente soll hier die Halbwertszeit verlängert werden (2). Außerdem wird aus China von einer bedingten Zulassung eines Nanobody-basierten Checkpoint-Inhibitors (Envafolimab) berichtet (2).

Darüber hinaus sind weltweit eine ganze Reihe von Nanobodies in Entwicklung oder in klinischen Studien (teils noch rekrutierend). Im Kontext solider Tumoren zielen diese u.a. auf CXCR4, DR5, Claudin18.2, VEGF + Ang2, PD-L1, CTLA-4, HER2, CEA, PSMA, GPC3, in Studien zu hämatologischen Neoplasien auf BCMA, CD19, CD20, CD7 u.a. (2). Außerdem werden therapeutische Nanobodies zur Miniaturisierung bekannter Therapieansätze erforscht, wie Nanobody-basierte antibody drug conjugates (ADC), die mit zytotoxischen Substanzen beladen sind, und Nanobody-basierte bispezifische T cell engager (BiTEs), die sowohl T-Zellen als auch Tumorzelle binden und so beide zusammenbringen können (2).

Nanobodies unterstützen Diagnostik und Monitoring

Nicht weniger interessant sind Nanobodies für das molekulare Imaging von Diagnostik und Monitoring. Für PET/SPECT wird konventionell der ­Radiotracer ¹⁸F-Fluor-2-Desoxyglukose (¹⁸F-FDG) genutzt. Um die Spezifität der Untersuchungen zu verbessern, wird daran gearbeitet, die PET mit Anti­körpern oder ADC zu kombinieren (ImmunoPET) (4). Im Vergleich zu den großen IgG-Antikörpern können hier Nanobodies mit ihrer verbesserten Gewebepenetranz und weniger schnellen Clearance von Vorteil sein. Nach bisherigen Daten werden Radiolabeled-Nanobodies von nicht-anvisiertem Gewebe (außer der Niere) wenig absorbiert, was die Target-to-Background Ratio verbessert. Außerdem werden versteckt liegende Epitope besser erreicht (2-4). Von Vorteil ist auch, dass Nanobodies Tandems und damit multispezifische und multivalente Konfigurationen bilden können. Dies könnte multifunktionales Drug Delivery ermöglichen und die Drug Antibody Ratio (DAR) bisheriger ADC verbessern (2, 3).

Von Primärtumor bis Metastasen

Für Diagnostik und Monitoring wird nach Möglichkeiten zur besseren Detektion von tumorspezifischen Antigenen und Immuninfiltration gesucht (2). Vor einigen Jahren wurde bereits in einer ersten Phase-I-Studie die sichere Anwendung eines ⁶⁸Ga-HER2-Nanobody (Konjugation p-SCN-Bn-NOTA-chelator an anti-HER2 Nanobody/2Rs15dHis6) zur Bestimmung des HER2-Status im PET/CT bei Mammakarzinom beschrieben (7). Positiv waren eine günstige Biodistribution, schnelle Aktivitätsabnahme im Blut (nach 1 h 10% Restaktivität im Blut) und hohe Akkumulation des Tracers in HER2-positiven Metastasen, wenngleich auch eine deutliche Aufnahme in Niere, Leber und Darm zu verzeichnen war. Die eingesetzte Strahlendosis war anderen routinemäßig genutzten PET-Tracern vergleichbar (7). Neben HER2 als Zielantigen der Nanobody-Diagnostik wird insbesondere auch an ⁶⁸Ga-labeled anti-Claudin18.2 gearbeitet, das in Tight-Junctions-Zellverbindungen bei Pankreas- und Magenkarzinomen überexprimiert wird (2).

Auch im Bereich diagnostischer Flow-Immuno-Assays, kompetitiver ELISA und Sandwich-ELISA bis hin zu Biosensoren wird am Einsatz von Nanobodies geforscht. So könnte ein In-vivo-Imaging mit CD4/CD8 T-Zell-PET-Tracern die Infiltration und Dynamik im Tumorgewebe besser erfassbar machen und die Vorhersage über Responder und Non-Responder unterstützen (4, 8).

Von Immunstatus bis Nano-GPS

Doch nicht nur die Onkologie, sondern auch das Monitoring von Infektionskrankheiten kann von den Entwicklungen profitieren (8). Für COVID-19 ist bekannt, dass neutralisierende Antikörper, die eine Rezeptor-bindende-Domäne (RBD) im Spike-Protein blockieren, die Infektion von Zellen verhindern und so zum Immunschutz beitragen können. Allerdings konnten die im Zuge der Pandemie rasch entwickelten und auf den Markt gebrachten SARS-CoV-2-Antikörpertests anfangs nicht zwischen neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Antikörpern unterscheiden (8). Das NeutrobodyPlex-System soll nun den Nachweis neutralisierender Antikörper ermöglichen, um den Immunstatus großer Bevölkerungsgruppen im Hochdurchsatz kontinuierlich monitoren und den Erfolg von Impfkampagnen besser beurteilen zu können (8).

Nicht zuletzt kann auch die Grundlagenforschung von der Entwicklung der Nanobodies profitieren. So bieten „Nano-GPS“ und „Nano-Staubsauger“ zum Entfernen von Proteinen aus Testzellen neue Möglichkeiten zur Aufklärung zellulärer Prozesse (9).


Es besteht kein Interessenkonflikt.
 

Serie: Neue Therapiekonzepte

Teil 1: Antikörper-Wirkstoff-Konjugate: Modularität bietet viele Stellschrauben (JOURNAL ONKOLOGIE 1/2024)